Carbapenemases of Serratia fonticola UTAD54

As carbapenemases, serínicas e metalo-β-lactamases (MBLs), formam um grupo cada vez mais importante de β-lactamases capazes de tornar as bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenemos utilizados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes. De modo a compreender melhor a relação estrutura-função deste grupo de enzimas, prosseguimos com a caracterização bioquímica e estrutural das carbapenemases SFC-1 e Sfh-I específicas de Serratia fonticola UTAD54, uma estirpe ambiental isolada previamente de águas de consumo não tratadas no Nordeste de Portugal. Ambas as β-lactamases foram sobre-expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia líquida. A SFC-1 recombinante, uma carbapenemase serínica, hidrolisa eficientemente antibióticos β-lactâmicos de todas as classes e exibe, comparativamente a enzimas relacionadas (ex. KPC), uma maior eficiência contra a ceftazidima e uma menor susceptibilidade aos inibidores convencionais das β-lactamases. As estruturas do cristal da SFC-1 nativa e de complexos de mutantes, obtidos por mutagénese dirigida, com o meropenemo não hidrolisado e na forma de acetilenzima foram determinados por substituição molecular utilizando cristalografia de raios-X. A estrutura da SFC-1 contém todas as características conservadas do centro activo das carbapenemases de classe A. Nas estruturas dos mutantes o meropenemo aparece orientado no centro activo por Thr236 e Thr238, posicionando-o próximo da Ser130 para a transferência do protão. Nas enzimas de classe A inibidas por carbapenemos, a interacção com a Arg244 impõe uma orientação diferente do meropenemo ligado, prejudicando a transferência do protão. Estas constituem as primeiras estruturas de uma carbapenemase de classe A com um carbapenemo no centro activo e revelam que estas enzimas alteram a orientação do meropenemo ligado para promover a catálise, sem alteração significativa da estrutura geral. A Sfh-I, tal como as outras MBLs da subclasse B2, apresenta um perfil de substratos reduzido, que inclui maioritariamente os carbapenemos. A Sfh-I hidrolisa imipenemo e meropenemo com um kcat de 51 e 109 s-1 e um KM de 79 e 215 μM, respectivamente. A Sfh-I liga um equivalente de zinco, como demonstrado por espectrometria de massa. Contrariamente a enzimas da subclasse B2 previamente caracterizadas, a Sfh-I hidrolisa a cefepima, mostrando que a Sfh-I é uma MBL da subclasse B2 com propriedades únicas. Por espectroscopia de fluorescência mostrou-se que a Sfh-I é capaz de ligar até 3 equivalentes de zinco (Kd2 = 95 μM; Kd3 = 2.3 mM). A estrutura do cristal da Sfh-I, determinada por substituição molecular utilizando a CphA como modelo, é a primeira para uma MBL da subclasse B2 não ligada. Esta estrutura revela a disposição das moléculas de água no centro activo corroborando um mecanismo catalítico para as MBLs da subclasse B2 no qual a His118, em vez do Asp120 proposto anteriormente, activa a molécula de água nucleofílica.

Smart design of scaffolds obtained by biofabrication for tissue engineering applications

A engenharia de tecidos é um domínio tecnológico emergente em rápido desenvolvimento que se destina a produzir substitutos viáveis para a restauração, manutenção ou melhoria da função dos tecidos ou órgãos humanos. Uma das estratégias mais predominantes em engenharia de tecidos envolve crescimento celular sobre matrizes de suporte (scaffolds), biocompatíveis e biodegradáveis. Estas matrizes devem possuir não só elevadas propriedades mecânicas e vasculares, mas também uma elevada porosidade. Devido à incompatibilidade destes dois parâmetros, é necessário desenvolver estratégias de simulação de forma a obter estruturas optimizadas. A previsão real das propriedades mecânicas, vasculares e topológicas das matrizes de suporte, produzidas por técnicas de biofabricação, é muito importante para as diversas aplicações em engenharia de tecidos. A presente dissertação apresenta o estado da arte da engenharia de tecidos, bem como as técnicas de biofabricação envolvidas na produção de matrizes de suporte. Para o design optimizado de matrizes de suporte foi adoptada uma metodologia de design baseada tanto em métodos de elementos finitos para o cálculo do comportamento mecânico, vascular e as optimizações topológicas, como em métodos analíticos para a validação das simulações estruturais utilizando dados experimentais. Considerando que as matrizes de suporte são estruturas elementares do tipo LEGO, dois tipos de famílias foram consideradas, superfícies não periódicas e as superfícies triplas periódicas que descrevem superfícies naturais. Os objectivos principais desta dissertação são: i) avaliar as técnicas existentes de engenharia de tecidos; ii) avaliar as técnicas existentes de biofabricação para a produção de matrizes de suporte; iii) avaliar o desempenho e comportamento das matrizes de suporte; iv) implementar uma metodologia de design de matrizes de suporte em variáveis tais como a porosidade, geometria e comportamento mecânico e vascular por forma a auxiliar o processo de design; e por fim, v) validar experimentalmente a metodologia adoptada.